大鼠骨髓间充质干细胞原代培养

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养 

一、实验动物

SD大鼠,2周龄,若干,购于第三军医大学实验动物中心。

二、主要仪器及试剂

1、主要仪器设备

电热压力蒸汽消毒灭菌锅(XDD)                  (浙江绍兴医疗器械总厂)

超净工作台                                   (苏州净化设备公司)

生物安全柜                                   (上海博讯实业有限公司) 

TC2323型CO2恒温细胞孵箱                      (美国SHEL LAB 公司)

电热恒温鼓风干燥箱                           (上海跃进医疗器械厂)

高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)               (美国Beckman公司)

0.22um除菌滤器                               (德国BM公司)

恒温循环水浴锅                               (Pharmacia公司生产)

迷你型超速离心机                             (德国Eppendorf公司生产)

微型高速冷冻离心机                           (德国Eppendorf公司生产)

纯水仪                                       (UVP公司生产)

4℃、-20℃冰箱                               (中国海尔公司)

制冰机                                       (华美公司)

1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) (德国)

细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) (美国)

各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管         (美国Axygen公司)

细胞计数板 (上海医用仪器厂)

微量移液器                                   (德国Eppendorf公司)

光学显微镜(OLYMPUS)      (日本)

倒置显微镜(OLYMPUS)      (日本)

照像系统(OLYMPUS) (日本)

小型台式离心机

(TGL-16G,中国)

电子分析天平

(Precisa12A,瑞士)

电热恒温水浴箱

(DK-8D,中国)

2、 主要试剂   

    DMEM-F12培养基                        (GIBCO,美国)

胎牛血清

    (GIBCO,美国)

胰蛋白酶

青/链霉素溶液(100X)

    (Beyotime,中国)

         (Beyotime,中国)

DMSO

    (Amresco,公司)

     PBS

     (中山,北京)

 

    台盼蓝粉末                             (Sigma,美国)

    淋巴细胞分离液                          (TBD)

3、 主要试剂配制

    (1)PBS:用购自中山公司的PBS粉剂,每袋加ddH2O定容至1000ml,调pH7.2,高压灭菌消毒。

三、 实验步骤

 1、细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入10%的胎牛血清和双抗,一般为血清。培养基分装成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求,制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL。

 2、大鼠骨髓间充质干细胞的分离

(1)取SD大鼠,颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉,PBS溶液冲洗两遍。

(3)从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。

(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。

(5)2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨髓基质细胞层(白色浑浊状),PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

(7)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,一般10d细胞生长融合。

(8)经0.25%胰酶消化,1:2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

、细胞形态观察

骨髓间充质细胞原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。

五、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,操作时不能大声说话,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

六、服务流程:



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