小鼠海马神经元细胞原代分离培养

小鼠海马神经元细胞原代分离培养  

一、实验动物

  新生24h 内清洁级C57小鼠若干,客户提供。

二、主要仪器及试剂

1、主要实验仪器

80/150/200目不锈钢细胞筛

上海生工,中国

电热压力蒸汽消毒器

浙江绍兴医疗器械总厂

超净工作台

苏州净化设备公司

二氧化碳培养箱

三洋(Sanyo),日本

电热恒温鼓风干燥箱

上海跃进医疗器械厂

低速台式离心机

上海安亭科学仪器厂

倒置显微镜    

OLYMPUS,日本

照像系统

OLYMPUS,日本

移液器

Eppendorf,德国

细胞计数板

上海医用仪器厂

细胞培养瓶及细胞培养板

Costar,美国

各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管           

Axygen,美国

0.22um纤维素滤膜       

MILLIPORE,美国

0.45um混合纤维素滤膜      

MILLIPORE,美国

剪刀、镊子

中山恒基达医疗器械

2、主要试剂

B27   

Gibco,美国

DMEM-F12培养基

Gibco,美国

Neurobasal A medium  

Gibco,美国

胎牛血清

Gibco,美国

胰蛋白酶

碧云天,中国

PBS

北京中杉

青霉素-链霉素溶液(100X)

碧云天,中国

DMSO

Amresco,美国

L-多聚赖氨酸    

sigma,美国

阿糖胞苷(Ara-C)

Pharmacia,美国

L-谷氨酰胺   

Gibco,美国

台盼蓝

Sigma,美国

多聚甲醛

国药集团

42

客户提供

3、主要试剂配制

(1)PBS磷酸盐缓冲液: PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL,调pH7.2,121℃,30min高压灭菌,44℃冰箱保存。

(2)接种液的配制:按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1:10,无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

(3)神经细胞维持培养液(无血清培养液)的制备 :Neurobasal;2%B-27;1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺;1%青链霉素。换液前 3h 配制,置于4℃备用。

(4)0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制:称量 10mg L-多聚赖氨酸,溶于 100ml 灭菌去离子水,0.22μm 正压滤器过滤分装,-20℃保存。 

(5)阿糖胞苷溶液的制备:  

a. Ara-C 储存液:称量 Ara-C 0.01g,溶于25mL去离子水中,即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装,置-20℃冰箱储存。 

b. Ara-C 工作液: Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释,即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。  

(6)0.4%台盼蓝溶液的配制:台盼蓝4 g,PBS少许(研磨),PBS定容至100mL,滤纸过滤,室温保存。 

(7)4%多聚甲醛的配制:多聚甲醛4g,PBS 100mL加热至 60℃,边滴加1mol/L NaOH边搅拌,至液体澄清。 

(8)四噻唑兰溶液配制:MTT50mg,PBS10mL磁力搅拌30min,0.22µm 微孔滤膜过滤分装,4℃保存,2周有效。 

三、细胞操作实验方法

1、小鼠海马神经元细胞的原代分离培养

(1)培养板的包被

用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片,37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。 

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液,灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片,晾干备用。 

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养 

(1)75%(体积分数)酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠,在无菌条件下脱颈处死,剪开头皮及颅骨,取出脑组织,置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中(下置冰袋)。

(2)无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上,在镜下小心翻开大脑皮质,暴露海马,用眼科剪或尖镊分离海马周围组织,取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

(3)用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块,0.125%胰蛋白酶消化,37℃作用 20min,期间振摇 2~3 次。

(4)弃去上清液,加入完全接种液终止消化,漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次,制成细胞悬液,静置 2min。

(5)悬液收集于新的离心管,离心(1000rpm,10 min,4℃),弃去上清液。加入完全培养液重悬,200 目不锈钢网过滤。

(6)将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。

(7)置 37℃、5%CO2培养箱培养 4-6h,全量更换为无血清培养液。

(8)体外培养第3d,加入Ara-C-工作液,以抑制非神经细胞过度增殖,作用 24 h后吸出。

(9)此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7~21d的细胞用于实验。

四、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

五、服务流程:



威斯腾生物服务项目


分子生物学检测蛋白质与免疫学动物实验
实时荧光定量PCR单克隆抗体制备帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗体制备抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术Western-blot 实验服务脊髓损伤模型
生化指标检测蛋白双向电泳实验服务脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测原核蛋白表达纯化骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表达纯化心肌缺血模型
GST pull DownITRAQ定量蛋白质组学心力衰竭模型
SLAC蛋白组学肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化实验课题整体外包粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化整体课题外包大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化细胞整体实验外包慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化动物整体实验外包过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片原代细胞培养肝纤维化模型
细胞因子芯片骨髓间充质干细胞培养胆结石模型
生长因子芯片脂肪干细胞培养急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片心肌成纤维细胞培养急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片软骨细胞培养体内血栓模型
生长因子芯片血管内皮细胞培养关节炎模型
炎症因子芯片神经元细胞培养I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片内皮组细胞原代培养裸鼠成瘤
凋亡因子芯片基因编辑动物
趋化因子芯片电生理相关服务动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片膜片钳实验
细胞生物学高通量测序代谢组学
细胞原代培养mRNA测序气相色谱GC/MS
MTT检测LncRNA测序液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测全基因组测序核磁共震NMR
细胞周期检测RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验外显子测序影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭16s扩增子测序Micro-CT
流式分选Small RNA测序小动物活体成像
CCK8/XTT检测宏基因组测序核磁共振
台盼蓝检测细胞活性单细胞测序PET-CT
药物筛选细胞学实验circleRNA测序
细胞粘附性检测甲基化测序基因编辑动物
细胞划痕实验条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理学检测CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入基因芯片
扫描电镜基因定点突变细胞系LncRNA芯片
透射电镜单基因敲除细胞系miRNA芯片
HE染色多基因敲除细胞系mRNA芯片
免疫组化目的基因敲入细胞系甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测报告基因敲入细胞系SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色CRISPR/Cas9动物敲除/敲入科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交基因敲除大鼠/小鼠科研文献论著翻译
荧光原位杂交基因敲入大鼠/小鼠SCI论文翻译润色服务
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等)临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测药物筛选服务项目药效学评价
水迷宫实验高通量自动药物筛选平台神经系统药物药效学评价
旷场实验细胞高内涵药物筛选平台抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测蛋白质组学靶标研发平台心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测分子药理研究平台泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳生物膜片钳药物筛选平台内分泌系统药物药效学评价
常规药物体外筛选抗炎免疫药物药效学评价

 

【本平台合作项目】

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!

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