大鼠膝关节软骨细胞的原代培养

大鼠膝关节软骨细胞的原代培养                

一、实验动物

SD大鼠,第三军医大学动物中心。

二、主要试剂及仪器

1、主要仪器

电热压力蒸汽消毒器(XDD)

(浙江绍兴医疗器械总)

超净工作台

(苏州净化设备公司)

TC2323型CO2恒温孵箱

(美国SHEL LAB 公司)

0.22um纤维素滤膜

(德国BM公司)

细胞培养瓶及细胞培养板(Costar)

(美国BD公司)

光学显微镜(OLYMPUS CK-40)

(日本)

倒置显微镜(OLYMPUS)

(日本)

细胞计数板

(上海医用仪器厂)

DMEM培养基

(Gibco,美国)

胰蛋白酶

(Hyclone,美国)

胎牛血清(FBS)

(Gibco/ Hyclone,美国)

PBS

(中山,北京)

青霉素和链霉素

(华北制药厂,中国)

2、实验主要试剂

 (1)PBS:用购自中山公司的PBS粉剂,每袋加ddH2O定容至1000ml,调pH7.2,高压灭菌消毒。

(2) DMEM细胞生长培养液:临用前根据需要加10%胎牛血清,1%的ITS,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

(3)抗生素:青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素,5ml灭菌水/链霉素),配制成20万u/ml分装,置于-20℃冰箱保存,临用时4℃解冻,注意尽量避免反复冻融,并使培养基最终浓度为100 u/ml。

(4)细胞冻存液:生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均匀,置于4℃冰箱保存。

 三、实验步骤

(1)取四周龄SD大鼠,颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离大腿腿骨,尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织;从关节处分离出软骨组织,将其剪成小于1mm3的组织块,用含双抗的PBS溶液冲洗两遍。

(3)软骨组织块静置5min,弃去上层液体及悬浮组织,往离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶,置入37℃的恒温摇床中,振荡消化15-20min;

(4) 4℃静置5min;弃上清,加入0.2%胶原酶II,置入37℃的恒温摇床中,振荡消化30~60min;
(5)加入生长培养基终止消化,反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min,弃上清,用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;

(7)放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。每3天更换培养液至第5天改为无血清培养液。免疫组化鉴定原代细胞。

四、细胞形态

    膝关节软骨原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞三角或多角形,生长缓慢,培养3-5天进入快速增殖期。

五、注意事项:

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

六、服务流程:



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