心肌成纤维细胞(CFs)原代培养

心肌成纤维细胞(CFs)原代培养                

一、实验动物

 清洁级SD大鼠乳鼠,若干,购于第三军医大学动物实验中心

二、主要仪器及试剂

1、主要实验仪器

80/150/200目不锈钢细胞筛

(上海生工,中国)

小型台式离心机

(TGL-16G,中国)

电子分析天平

(Precisa12A,瑞士)

千分之一电子天平

(GB303 Mettler-Toledo Instr. Ltd)

移液器

(eppendorf,德国)

电热恒温水浴箱

(DK-8D,中国)

旋涡振荡器

(QL-901,中国)

光学倒置显微镜

(Olympus AX70,日本)

隔水式电热恒温培养箱

(XMTH-142,中国)

细胞培养箱

(Shellab,美国)

超净工作台

(VS-1300,中国苏州)

纯水仪

高压灭菌锅

台式水浴恒温振荡摇床  SHZ-88

    0.22um纤维素滤膜       

0.45um混合纤维素滤膜

细胞培养瓶及细胞培养板

细胞计数板   

MILLIPORE,德国)

(上海赛洋,中国)

(江苏太仓市实验设备厂,中国)

(BM,德国)

(BM,德国)

(Costar,美国)

(上海医用仪器厂,中国)

2、主要试剂

                      DMEM-F12培养基                           (Gibco,美国)

    胰蛋白酶                               (Beyotime,美国)

    PBS                                ( 中山,北京)

    胎牛血清                                   (Gibco,美国)

    青霉素                                (华北制药厂,中国)

    链霉素                                (华北制药厂,中国)

3、主要试剂配制

(1)PBS:用购自中山公司的PBS粉剂,每袋加ddH2O定容至1000ml,调pH7.2,高压灭菌消毒。

(2) 0.25%胰蛋白酶消化液:使用时浓度为0.25%,含0.02%EDTA,制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液,并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤,50ml分装,4℃保存。

(3) DMEM-F12细胞生长培养液:临用前根据需要加10%胎牛血清,1%的ITS,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

(4)抗生素:青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素,5ml灭菌水/链霉素),配制成20万u/ml分装,置于-20℃冰箱保存,临用时4℃解冻,注意尽量避免反复冻融,并使培养基最终浓度为100 u/ml。

(5)细胞冻存液:生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均匀,置于4℃冰箱保存。

三、细胞操作实验方法

1、细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和双抗,一般为10%~20%血清。培养基分装成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求,制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清+1%ITS,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL。

2、大鼠心肌成纤维细胞原代分离培养

(1)将SD乳鼠在75%酒精中浸泡1-5min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子,先用酒精棉球再次消毒,剪开胸,取心尖部位,快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3遍。

(2)剔除周围结缔组织,将心脏置于无菌平皿中,将心脏尽量剪碎,平皿内加入适量0.125%的胰酶,在37度培养箱中,采用分次消化,每次消化5分钟,一共消化8~10次。

(3)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基,轻轻混匀,中和胰酶的消化,防止消化多度。用100目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液,最后将过滤后的细胞悬液1000R/MIN离心5分钟。离心后收集沉淀,用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬。于细胞培养瓶中培养。

(4)在培养90分钟左右,将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞,加入DMEM/F12培养基,放入培养瓶继续培养。

(5)24h换液,并每日观察心肌成纤维细胞的生长。

四、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,操作时不能大声说话,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

五、服务流程:



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