心肌成纤维细胞(CFs)原代培养


心肌成纤维细胞(CFs)原代培养

一、实验动物

清洁级SD大鼠乳鼠,若干,购于第三军医大学动物实验中心

二、主要仪器

80/150/200目不锈钢细胞筛

(上海生工,中国)

小型台式离心机

(TGL-16G,中国)

电子分析天平

(Precisa12A,瑞士)

千分之一电子天平

(GB303 Mettler-Toledo Instr. Ltd)

移液器

(eppendorf,德国)

电热恒温水浴箱

(DK-8D,中国)

旋涡振荡器

(QL-901,中国)

光学倒置显微镜

(Olympus AX70,日本)

隔水式电热恒温培养箱

(XMTH-142,中国)

细胞培养箱

(Shellab,美国)

超净工作台

(VS-1300,中国苏州)

纯水仪

高压灭菌锅

台式水浴恒温振荡摇床  SHZ-88

   0.22um纤维素滤膜       

0.45um混合纤维素滤膜

细胞培养瓶及细胞培养板

细胞计数板   

(MILLIPORE,德国)

(上海赛洋,中国)

(江苏太仓市实验设备厂,中国)

(BM,德国)

(BM,德国)

(Costar,美国)

(上海医用仪器厂,中国)

三、主要试剂配制

(1)PBS:用购自中山公司的PBS粉剂,每袋加ddH2O定容至1000ml,调pH7.2,高压灭菌消毒。

(2) 0.25%胰蛋白酶消化液:使用时浓度为0.25%,含0.02%EDTA,制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液,并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤,50ml分装,4℃保存。

(3) DMEM-F12细胞生长培养液:临用前根据需要加10%胎牛血清,1%的ITS,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

(4)抗生素:青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素,5ml灭菌水/链霉素),配制成20万u/ml分装,置于-20℃冰箱保存,临用时4℃解冻,注意尽量避免反复冻融,并使培养基最终浓度为100 u/ml。

(5)细胞冻存液:生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均匀,置于4℃冰箱保存。

四、细胞操作实验方法

1、细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和双抗,一般为10%~20%血清。培养基分装成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求,制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清+1%ITS,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL。

2、大鼠心肌成纤维细胞原代分离培养

1)将SD乳鼠在75%酒精中浸泡1-5min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子,先用酒精棉球再次消毒,剪开胸,取心尖部位,快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3遍。

2)剔除周围结缔组织,将心脏置于无菌平皿中,将心脏尽量剪碎,平皿内加入适量0.125%的胰酶,在37度培养箱中,采用分次消化,每次消化5分钟,一共消化8~10次。

3)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基,轻轻混匀,中和胰酶的消化,防止消化多度。用100目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液,最后将过滤后的细胞悬液1000R/MIN离心5分钟。离心后收集沉淀,用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬。于细胞培养瓶中培养。

4)在培养90分钟左右,将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞,加入DMEM/F12培养基,放入培养瓶继续培养。

5)24h换液,并每日观察心肌成纤维细胞的生长。

五、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,操作时不能大声说话,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

服务流程




威斯腾生物服务项目

分子生物学检测蛋白质与免疫学动物实验
实时荧光定量PCR单克隆抗体制备帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗体制备抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术Western-blot 实验服务脊髓损伤模型
生化指标检测蛋白双向电泳实验服务脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测原核蛋白表达纯化骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表达纯化心肌缺血模型
GST pull DownITRAQ定量蛋白质组学心力衰竭模型
SLAC蛋白组学肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化实验课题整体外包粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化整体课题外包大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化细胞整体实验外包慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化动物整体实验外包过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片原代细胞培养肝纤维化模型
细胞因子芯片骨髓间充质干细胞培养胆结石模型
生长因子芯片脂肪干细胞培养急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片心肌成纤维细胞培养急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片软骨细胞培养体内血栓模型
生长因子芯片血管内皮细胞培养关节炎模型
炎症因子芯片神经元细胞培养I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片内皮组细胞原代培养裸鼠成瘤
凋亡因子芯片基因编辑动物
趋化因子芯片电生理相关服务动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片膜片钳实验
细胞生物学高通量测序代谢组学
细胞原代培养mRNA测序气相色谱GC/MS
MTT检测LncRNA测序液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测全基因组测序核磁共震NMR
细胞周期检测RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验外显子测序影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭16s扩增子测序Micro-CT
流式分选Small RNA测序小动物活体成像
CCK8/XTT检测宏基因组测序核磁共振
台盼蓝检测细胞活性单细胞测序PET-CT
药物筛选细胞学实验circleRNA测序
细胞粘附性检测甲基化测序基因编辑动物
细胞划痕实验条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理学检测CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入基因芯片
扫描电镜基因定点突变细胞系LncRNA芯片
透射电镜单基因敲除细胞系miRNA芯片
HE染色多基因敲除细胞系mRNA芯片
免疫组化目的基因敲入细胞系甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测报告基因敲入细胞系SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色CRISPR/Cas9动物敲除/敲入科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交基因敲除大鼠/小鼠科研文献论著翻译
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行为学检测药物筛选服务项目药效学评价
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重复性刻板行为检测蛋白质组学靶标研发平台心血管系统药物药效学评价
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常规药物体外筛选抗炎免疫药物药效学评价




【本平台合作项目】

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!

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