大鼠脂肪间充质干细胞原代培养

大鼠脂肪间充质干细胞原代培养

一、实验动物

     大鼠,北京华阜康生物科技股份有限公司。

二、主要仪器及试剂

80/150/200目不锈钢细胞筛

上海生工,中国

电热压力蒸汽消毒器

浙江绍兴医疗器械总厂

超净工作台

苏州净化设备公司

二氧化碳培养箱

三洋(Sanyo),日本

电热恒温鼓风干燥箱

上海跃进医疗器械厂

低速台式离心机

上海安亭科学仪器厂

倒置显微镜    

OLYMPUS,日本

照像系统

OLYMPUS,日本

移液器

Eppendorf,德国

细胞计数板

上海医用仪器厂

细胞培养瓶及细胞培养板

Costar,美国

各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管           

Axygen,美国

0.22um纤维素滤膜       

MILLIPORE,美国

0.45um混合纤维素滤膜      

MILLIPORE,美国

剪刀、镊子

中山恒基达医疗器械

2、主要试剂

DMEM培养基                            

Gibco,美国

胎牛血清(FBS)

Gibco,美国

胰蛋白酶

碧云天,中国

PBS

北京中杉

青霉素-链霉素溶液(100X)

碧云天,中国

DMSO

Amresco,美国

3、主要试剂配制

(1)PBS磷酸盐缓冲液: PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL,调pH7.2,121℃,30min高压灭菌,4℃冰箱保存。

(2)DMEM细胞生长培养液:临用前根据需要按体积比10%加胎牛血清,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,再加入5ng/mL的SCF,置于4℃冰箱保存。

(3)细胞冻存液:生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均匀,置于4℃冰箱保存。

 三、实验步骤

1. 取大鼠,使用7%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉,在无菌条件下迅速取出脂肪组织。

 2. 用含1%青链双抗的D-Hank’s 液冲洗3次。剥离脂肪组织上的血管。
 3. 将脂肪组织剪碎,直到组织变为液体状,加入8-10mL 胰酶,37℃消化90min。
 4. 消化完成后,加入等量含血清DMEM 培养基终止消化,过200目筛网去除大块组织
 5. 以1500r/min 离心5min,去上清液,加入含血清DMEM 培养基重悬细胞。

 6. 接种至6 孔板,放入细胞培养箱(37℃,CO2 浓度5%)。细胞稳定培养24h后换液,冲去未贴壁的细胞,更换DMEM培养基(成分同上)继续培养。以后每2天换液1 次,注意观察培养基有无浑浊、颜色变淡、漂浮物和絮状物等

 四、细胞形态

大鼠脂肪间充质干细胞培养过程中,约24h即可贴壁生长,细胞呈长梭形生长速度较慢。换液后细胞增殖明显,出现以长梭形为主的形态,5- 7d  70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈长梭形。

五、服务流程:


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