免疫共沉淀(IP)

                                  

                            

                       免疫共沉淀实验技术(IP


 免疫共沉淀实验技术


IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarosebeads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

二、实验仪器

高速组织捣碎机: SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E

电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C

电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)

转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)

低温高速离心机:湖南湘仪公司(型号:H2050R)

超低温冰箱:美国FORMA公司(型号:702

分光光度计:上海分析仪器总厂(型号:721)

脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)

三、主要试剂

HRP标记山羊抗小鼠二抗:北京中山(货号:ZB-2305)

蛋白质预染分子量marker:Fermentas

A蛋白-sepharose珠:Pharmacia Biotech公司产品

NC膜:Millipore公司(型号:0.45um)

化学发光底物底物:PIERCE公司

电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品

其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品

总蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所

 

四、操作流程

1.样品准备:

1)取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF,混匀,超声波破碎细胞

2)4℃,12000rpm离心10min

3)取上清夜,-70℃冻存24hr

5)4℃ 12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。 

2.定蛋白及计算电泳上样量:

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug

3.免疫沉淀:

1)准备A蛋白-Sepharose珠:用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

2)准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物:按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗,4℃孵育1 h,8000rpm离心5 min,PBS洗涤3次,加50ulPBS

3)取100 μg总蛋白,加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物,4℃轻摇2h,PBS洗涤3次,之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液,100℃变性3 min,以游离抗原、抗体、珠子,8000 rpm室温离心5 min,蛋白上清储于-20℃备用。

4.电泳:

1)安装好电泳装置

2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

3)30min后,待凝后倾去封液

4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干

5)上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳

7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

5.转膜及检测:

1)准备2个12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板)

4)完全排除气泡, 4℃,100mA转膜2hr。

5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗

8)37℃摇床孵育约2hr

9)PBST洗涤4次,每次5min

10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min

11)PBST洗涤4次,每次5min

12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物(A液与B液等体积混和),室温孵育5min后

13)取出NC膜,去尽残液,包好,放入X-光片夹中显影

14)扫描及分析

6.结果:

用Quantity One 4.3.1(Bio-rad)软件对照片进行分析(注意:Trace表示 Band光密度分布曲线下面积)

 

五、服务流程 

 


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