Tunel(原位末端凋亡法)

                 

              原位末端凋亡法(Tunel)实验技术

一、TUNEL 技术简介:

TUNEL 技术, 即脱氧核苷酸末端转移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT )介导的x2dU TP 缺口末端标记(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL ) 技术, 是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法, 已广泛用于生物、医学研究领域。

TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.TdTterminal deoxynucleotidyl transferase,此种酵素可以在没有DNA模板的情形下,连结核甘酸到DNA3'-OH.1992,以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素,自此衍生出TUNEL此项技术.TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期,即可侦测到DNA片段的产生,并且可以直接使用在组织切片上,观察细胞凋亡发生的位置.所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法


二、试剂与耗材


试剂

1TUNEL试剂盒:购自罗氏公司

2DABSigma

3PBSTBS缓冲液:国药集团


仪器

切片机:德国LeicaRM2145

展片机:德国LeicaHI1210

烤片机:德国LeicaHI1220


三、操作流程

1、石蜡切片,常规脱蜡至水; 石蜡切片4um贴在涂有切片粘合剂的载玻片上,58C24h,常规脱蜡至水,二甲苯Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 各10分钟,无水乙醇,95%85%75%乙醇,各2分钟,水洗2分钟。

2、0.3%H2O2作用  30min,室温,PBS3min×3次;

3、Proteinase K 20ug/ml  37 20min

4、PBS3min×3次;

5、0.1%Triton×100 PBS3min×3次;

6、PBS3min×3次;

7、TUNEL混合液---1ml Tunel缓冲液中加入10ul  b-11-DUTP, 10ul  TDT, 37C  1h,室温1h

8、PBS3min×3次;

9、Streptavidin-HRP  1:400  37C  30min

10、PBS3min×3次;

11、0.04%DAB+0.03%H2O2显色10min,流水洗

12、苏木精衬染1min,盐酸乙醇分化,水洗

13、常规树脂封片

 

四、结果提供:阳性结果为棕黄色(核)或棕褐色,背景呈紫蓝色。

1、完整的实验报告(包含试剂、耗材、操作步骤、病理结果);

2、原始病理照片,一般提供100倍、400倍照片各2张;

3、如果客户提供的是组织,我们提供包埋、染色片

 

五、样本要求

取材保持组织新鲜(组织块以小于2cm*1.5cm*0.3cm为宜),立即放入固定液(固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液,体积为组织块的10倍以上)中,避免干燥;对于有血迹的样本,可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中;经固定后的样本必须在48小时内处理

 

五、服务流程:



【本平台合作项目】

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