1. Product Information

Name	C57BL/6-XXXtm1cyagen
Serial Number	KOCMP-21018-XXX
Gene	XXX
NCBI ID	18024
Strain	C57BL/6
Type	conventional knockout

2. gRNA target sequence

gRNA1 (matching forward strand ofgene): CAGCCCTTGGTTAGCAGCGCAGG

gRNA2 (matching forward strand of gene): TTCTATACTAAACGTTAGCTAGG

3. Delivery Information

 4. Genotyping Strategy

5. PCR Screening

Animals 2 and 6 were identified positive by PCR screening.

Note:

1)PCR was carried out in 25 µL volume for 35 cycles under standard conditions, with primers listed above added to each reaction.

 2) Taq DNA polymerase used was P112-01.

 3) Two controls used in PCR genotyping are:

 Ø Water control: No DNA template added.

 Ø Wildtype control: 400 ng of mouse genomic DNA.  

6. Sequencing Confirmation

Sequencing Primer for PCR product:

Sequence primer (F1): 5’-GAAGCATTATCATTTGGTGGGAAC-3’

Sequencing Results:

Positive animals

Mouse ID: 2, 6 (Deleted 4961 bp and inserted 28 bp)

7. Breeding and Genotyping strategy

8. 配种与繁殖汇总

小鼠配种与繁殖情况如下图所示。

（1）+/+为DNA双链都含有XXX基因，即野生型小鼠；+/-为只有一条DNA链含有XXX基因，即杂合子小鼠；-/-为DNA双链都不含XXX基因，即纯合子小鼠。

       （2）红色字体标记表示纯合子小鼠，蓝色字体标记表示小鼠已死亡。

      PCR鉴定

     （1）5/9，2#，6#鉴定。

     根据图一，说明：2-1、6-1用引物F1/R1进行PCR；2-2、6-2用引物F1/R2进行PCR。鉴定结果：2#，6#为杂合子。

      （2）5/19，7#~13#鉴定。

       根据图二，说明：前面是用引物F1/R1进行PCR；后面是用引物F1/R2进行PCR。鉴定结果：7#、9#、10#为纯合子；11#、12#、13#为杂合子；8#为野生小鼠。其中11#引物F1/R1条带不明显，后续重新取材鉴定。