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原代细胞培养
脂肪/骨髓/牙源间充质干细胞

时间:2020-07-17 16:29:00 浏览:779次


威斯腾生物经过10多年的发展,获得了上百种细胞株和四十余种原代细胞培养经验,并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库。细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件,万级净化细胞房,这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。 同时,威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验,结合平台已有的技术优势,建立了完善的体外药筛实验,并引进RTCA(Real-time cellular Analysis,实时无标记细胞记录仪),在药筛过程中,全程实时记录细胞真实状况,为药筛提供最真实精准的实验数据。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离

操作方法

(1)取SD大鼠(2周龄),颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉,PBS溶液冲洗两遍。

(3)从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。

(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。

(5)2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨髓基质细胞层(白色浑浊状),PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

(7)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,一般10d细胞生长融合。

(8)经0.25%胰酶消化,1:2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

细胞形态

骨髓间充质细胞原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。


大鼠脂肪间充质干细胞的分离

操作步骤

1. 取大鼠,使用7%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉,在无菌条件下迅速取出脂肪组织。
2. 用含1%青链双抗的D-Hank’s 液冲洗3次。剥离脂肪组织上的血管。
3. 将脂肪组织剪碎,直到组织变为液体状,加入8-10mL 胰酶,37℃消化90min。
4. 消化完成后,加入等量含血清DMEM 培养基终止消化,过200目筛网去除大块组织。
5. 以1500r/min 离心5min,去上清液,加入含血清DMEM 培养基重悬细胞。

6. 接种至6 孔板,放入细胞培养箱(37℃,CO2 浓度5%)。细胞稳定培养24h后换液,冲去未贴壁的细胞,更换DMEM培养基(成分同上)继续培养。以后每2天换液1 次,注意观察培养基有无浑浊、颜色变淡、漂浮物和絮状物等

细胞形态

大鼠脂肪间充质干细胞培养过程中,约24h即可贴壁生长,细胞呈长梭形生长速度较慢。换液后细胞增殖明显,出现以长梭形为主的形态,5- 7d 70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈长梭形。


牙源间充质干细胞分离

操作步骤

(1)取SD乳大鼠,颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀解剖出大鼠已萌的牙根发育中的第一磨牙,沿Hertwig上皮起始处横切分离出包括根尖乳头、Hertwig上皮、牙囊的根端复合体,PBS溶液冲洗两遍。

(3)组织块剪碎,然后采用酶消化法消化培养,单细胞悬液以1X105细胞/ml在加了15%胎牛血清及青链霉素的a-MEM培养基中,置37℃、5%CO2恒温培养箱进行培养。

(4)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,一般10d细胞生长融合。

(5)经0.25%胰酶消化,1:2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

细胞形态

牙源间充质细胞原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。


威斯腾实验服务流程


威斯腾生物服务项目

分子生物学检测 蛋白质与免疫学 动物实验
实时荧光定量PCR 单克隆抗体制备 帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗体制备 抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 Western-blot实验服务 脊髓损伤模型
生化指标检测 蛋白双向电泳实验服务 脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测 原核蛋白表达纯化 骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表达纯化 心肌缺血模型
GST pull Down ITRAQ定量蛋白质组学 心力衰竭模型
SLAC蛋白组学 肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装 实验课题整体外包 粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化 整体课题外包 大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化 细胞整体实验外包 慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化 动物整体实验外包 过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化 肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片 原代细胞培养 肝纤维化模型
细胞因子芯片 骨髓间充质干细胞培养 胆结石模型
BioPlex悬浮芯片 脂肪干细胞培养 急性胰腺炎模型
生长因子芯片 心肌成纤维细胞培养 急性肾衰竭模型
炎症因子芯片 软骨细胞培养 体内血栓模型
血管生成因子芯片 血管内皮细胞培养 关节炎模型
凋亡因子芯片 神经元细胞培养 I型和II型糖尿病模型
趋化因子芯片 内皮组细胞原代培养 裸鼠成瘤
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 基因编辑动物
电生理相关服务 动物整体实验服务
膜片钳实验
细胞生物学检测 高通量测序 代谢组学
细胞原代培养 mRNA测序 气相色谱GC/MS
MTT检测 LncRNA测序 液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测 全基因组测序 核磁共震NMR
细胞周期检测 RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验 外显子测序 影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭 16s扩增子测序 Micro-CT
流式分选 Small RNA测序 小动物活体成像
CCK8/XTT检测 宏基因组测序 核磁共振
台盼蓝检测细胞活性 单细胞测序 PET-CT
药物筛选细胞学实验 circleRNA测序
细胞粘附性检测 甲基化测序 基因编辑动物
细胞划痕实验 条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验 全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理检测 CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 基因芯片
扫描电镜 基因定点突变细胞系 LncRNA芯片
透射电镜 单基因敲除细胞系 miRNA芯片
HE染色 多基因敲除细胞系 mRNA芯片
免疫组化 目的基因敲入细胞系 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测 报告基因敲入细胞系 SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色 CRISPR/Cas9动物敲除/敲入 科研设计指导&文章评估/润色
原位杂交 基因敲除大鼠/小鼠 科研文献论著翻译
荧光原位杂交 基因敲入大鼠/小鼠 论文翻译润色服务
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等) 临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测 药物筛选服务项目 药效学评价
旷场实验 高通量自动药物筛选平台 抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测 细胞高内涵药物筛选平台 心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测 蛋白质组学靶标研发平台 泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳 分子药理研究平台 内分泌系统药物药效学评价
生物膜片钳药物筛选平台 抗炎免疫药物药效学评价
常规药物体外筛选


【本平台合作项目】

分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!

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