威斯腾生物经过10多年的发展，获得了上百种细胞株和四十余种原代细胞培养经验，并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库。细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件，万级净化细胞房，这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。 同时，威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验，结合平台已有的技术优势，建立了完善的体外药筛实验，并引进RTCA(Real-time cellular Analysis，实时无标记细胞记录仪），在药筛过程中，全程实时记录细胞真实状况，为药筛提供最真实精准的实验数据。

无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

牛视网膜血管内皮细胞

（1）取成牛眼球，75%酒精消毒，取出周围多余组织，用PBS洗3次，用PBS流水冲洗眼球3次。

（2）沿角膜缘剪开眼球，弃掉角膜、晶体、玻璃体等部分，将眼球后半部翻转取出视网膜，将其剪碎平皿内加入适量0.25%的胰酶，在37℃培养箱中，采用分次消化，每次消化20min约8次。

（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM培养基，轻轻混匀，中和胰酶的消化，防止消化过度。用200目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液，最后将过滤后的细胞悬液1000rpm离心5min。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬，接种于细胞培养瓶中培养，并每日观察细胞的生长，接种后约4d后有少量细胞贴壁。

小鼠脑微血管内皮细胞分离

1.C57小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)。

2. 随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。
3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 ℃水浴消化1.5 h。
4. 离心(1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液，加入20% BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4 ℃)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。
5. 加入3 ml 2.5%胰酶消化液消化20min，加入等量含血清培养基终止消化，离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
6. 离心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液。
7. 加入DMEM完全培养液(含20% FBS)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。

细胞形态

脑微血管内皮细胞原代培养过程中，约24h即可贴壁生长，细胞呈长梭形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，5- 7d 70%-80%可融合达到传代标准。

威斯腾实验服务流程

威斯腾生物服务项目

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