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原代细胞培养
小鼠海马/大鼠脊髓神经元细胞

时间:2020-07-17 16:26:00 浏览:2613次


威斯腾生物经过10多年的发展,获得了上百种细胞株和四十余种原代细胞培养经验,并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库。细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件,万级净化细胞房,这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。 同时,威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验,结合平台已有的技术优势,建立了完善的体外药筛实验,并引进RTCA(Real-time cellular Analysis,实时无标记细胞记录仪),在药筛过程中,全程实时记录细胞真实状况,为药筛提供最真实精准的实验数据。

无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯和臭氧杀菌1h,然后通风30min,操作前需要换细胞间专用拖鞋,双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上一次性口罩和帽子,操作时不能大声说话,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。


小鼠海马神经元细胞的原代分离培养

1、培养板的包被

用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片,37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液,灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片,晾干备用。

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养

(1)75%(体积分数)酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠,在无菌条件下脱颈处死,剪开头皮及颅骨,取出脑组织,置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中(下置冰袋)。

(2)无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上,在镜下小心翻开大脑皮质,暴露海马,用眼科剪或尖镊分离海马周围组织,取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

(3)用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块,0.125%胰蛋白酶消化,37℃作用 20min,期间振摇 2~3 次。

(4)弃去上清液,加入完全接种液终止消化,漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次,制成细胞悬液,静置 2min。

(5)悬液收集于新的离心管,离心(1000rpm,10 min,4℃),弃去上清液。加入完全培养液重悬,200 目不锈钢网过滤。

(6)将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。

(7)置 37℃、5%CO2培养箱培养 4-6h,全量更换为无血清培养液。

(8)体外培养第3d,加入Ara-C-工作液,以抑制非神经细胞过度增殖,作用 24 h后吸出。

(9)此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7~21d的细胞用于实验。


大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

1、培养板的包被

(1)将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小,洗洁精浸洗、烘干。

(2)经 5%盐酸浸泡30min,自来水冲洗20min,三蒸水冲洗,浸泡过夜并烘干;移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干,放入 24 孔细胞培养板。

(3)用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片,37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃 L-多聚赖氨酸溶液,灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片,晾干备用。

2、大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

(1) 75%(体积分数)酒精消毒新生 24h 内的健康SD大鼠,在无菌条件下断头,分离并切取脊髓,置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中(下置冰袋)。

(2) 无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3) 用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块,0.125%胰蛋白酶消化,37℃作用 10min,期间振摇 2~3 次。

(4)巴斯德吸管轻轻吹打 20次,静置 5min,将细胞上清移入新的无菌离心管,加入完全接种液终止消化。剩余组织按照上述步骤继续消化,重复2-3次,制成细胞悬液。

(5)将新的离心管中细胞悬液,离心(1000r/min,10 min,4℃),弃去上清液。加入完全培养液重悬,200 目不锈钢网过滤。

(6)将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以 400µl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24 孔培养板

(7)置 37℃、5%CO2培养箱培养 4~6h,全量更换为无血清培养液。

(8)体外培养第 3天,加入Ara-C 工作液,以抑制非神经细胞过度增殖,作用 24 h后吸出。

(9) 此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7~21天的细胞用于实验。


威斯腾实验服务流程



威斯腾生物服务项目

分子生物学类 蛋白质与免疫学 动物实验
实时荧光定量PCR 单克隆抗体制备 帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗体制备 抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 Western-blot 实验服务 脊髓损伤模型
生化指标检测 蛋白双向电泳实验服务 脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测 原核蛋白表达纯化 骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表达纯化 心肌缺血模型
GST pull Down ITRAQ定量蛋白质组学 心力衰竭模型

SLAC蛋白组学 肺动脉高血压动物模型


高血压模型
病毒类 实验课题整体外包 粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化 整体课题外包 大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化 细胞整体实验外包 慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化 动物整体实验外包 过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化
肺炎大鼠模型


肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片 原代细胞培养 肝纤维化模型
细胞因子芯片 骨髓间充质干细胞培养 胆结石模型
生长因子芯片 脂肪干细胞培养 急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片 心肌成纤维细胞培养 急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片 软骨细胞培养 体内血栓模型
生长因子芯片 血管内皮细胞培养 关节炎模型
炎症因子芯片 神经元细胞培养 I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片 内皮组细胞原代培养 裸鼠成瘤
凋亡因子芯片
基因编辑动物
趋化因子芯片 电生理相关服务 动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 膜片钳实验
细胞生物学 高通量测序 代谢组学
细胞原代培养 mRNA测序 气相色谱GC/MS
MTT检测 LncRNA测序 液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测 全基因组测序 核磁共震NMR
细胞周期检测 RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验 外显子测序 影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭 16s扩增子测序 Micro-CT
流式分选 Small RNA测序 小动物活体成像
CCK8/XTT检测 宏基因组测序 核磁共振
台盼蓝检测细胞活性 单细胞测序 PET-CT
药物筛选细胞学实验 circleRNA测序
细胞粘附性检测 甲基化测序 基因编辑动物
细胞划痕实验
条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验
全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验

病理类 CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 基因芯片
扫描电镜 基因定点突变细胞系 LncRNA芯片
透射电镜 单基因敲除细胞系 miRNA芯片
HE染色 多基因敲除细胞系 mRNA芯片
免疫组化 目的基因敲入细胞系 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测 报告基因敲入细胞系 SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光

Masson染色 CRISPR/Cas9动物敲除/敲入
原位杂交 基因敲除大鼠/小鼠
荧光原位杂交 基因敲入大鼠/小鼠
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等)

行为学检测 药物筛选服务项目 药效学评价
水迷宫实验 高通量自动药物筛选平台 神经系统药物药效学评价
旷场实验 细胞高内涵药物筛选平台 抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测 蛋白质组学靶标研发平台 心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测 分子药理研究平台 泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳 生物膜片钳药物筛选平台 内分泌系统药物药效学评价

常规药物体外筛选 抗炎免疫药物药效学评价


【本平台合作项目】

分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!
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