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细胞生物学检测
MTT/CCK8/XTT检测

时间:2020-07-20 17:40:00 浏览:628次

一、实验介绍

(a) MTT

MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂,生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中,甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比(死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失,不能还原MTT)。还原生成的甲月替结晶可在含50%N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠(PH 4.7)或10%酸化十二甲基磺酸钠(PH 4.7)的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出OD值,即反映活细胞数目。也可利用DMSO(二甲基亚砜)来溶解。用DMSO之前要尽量去掉培养液,一遍DMSO溶解甲月替颗粒,进行比色测定。

1.取96孔细胞培养板,每孔中加0.1ml2×10410×104靶细胞的培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养液),在37 5 CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养23小时让细胞帖壁(如果是悬浮细胞可直接进行下一步)

2.用RPMI-1640培养液210倍递次稀释细胞因子标准品,根据情况25倍递次稀释待检样品,每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品,每个稀释度3个重复孔。对照孔6个:3个阳性对照孔,每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液,3个阴性对照孔,每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37 5 CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2448小时或预定的时间。

3.吸去培养液,用PBS洗涤一次(如为悬浮细胞,应在吸去上清液前离心培养板)。

4.每孔加0.1ml PBS10μl MTT染液,在37 5 CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养46小时。

5.每孔加0.1ml酸化异丙醇,也可用含10 SDS10mmol/L HCl代替酸化异丙醇,在振荡器上振荡混匀,让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度(OD)值,检测波长570nm,参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图,比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。


(b) CCK-8检测细胞增殖(活力):

CCK-8cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazanWST-8产生的formazanXTTMTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTTMTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTTXTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。

当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。


(c) XTT

化学名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide,作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的产物的吸光度与活细胞的数量成正比。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤,XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物(formazan)。代谢产物在OD450处有吸收峰。优点:1、使用方便,省去了洗涤细胞;2、检测快速;3、灵敏度高,甚至可以测定较低细胞密度;4、重复性优于MTT。 缺点:XTT水溶液不稳定,需要低温保存或现配现用。

二、应用范围

生物活性因子的活性检测;

大规模的抗肿瘤药物筛选;

细胞增殖实验;

药物或基因导致的细胞毒性试验;

药敏试验等。

三、服务周期

15-25个工作日

四、服务流程




威斯腾生物服务项目


分子生物学检测 蛋白质与免疫学 动物实验
实时荧光定量PCR 单克隆抗体制备 帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗体制备 抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 Western-blot 实验服务 脊髓损伤模型
生化指标检测 蛋白双向电泳实验服务 脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测 原核蛋白表达纯化 骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表达纯化 心肌缺血模型
GST pull Down ITRAQ定量蛋白质组学 心力衰竭模型
SLAC蛋白组学 肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化 实验课题整体外包 粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化 整体课题外包 大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化 细胞整体实验外包 慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化 动物整体实验外包 过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化 肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片 原代细胞培养 肝纤维化模型
细胞因子芯片 骨髓间充质干细胞培养 胆结石模型
生长因子芯片 脂肪干细胞培养 急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片 心肌成纤维细胞培养 急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片 软骨细胞培养 体内血栓模型
生长因子芯片 血管内皮细胞培养 关节炎模型
炎症因子芯片 神经元细胞培养 I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片 内皮组细胞原代培养 裸鼠成瘤
凋亡因子芯片 基因编辑动物
趋化因子芯片 电生理相关服务 动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 膜片钳实验
细胞生物学 高通量测序 代谢组学
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MTT检测 LncRNA测序 液相色谱LC/MS
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细胞周期检测 RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验 外显子测序 影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭 16s扩增子测序 Micro-CT
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CCK8/XTT检测 宏基因组测序 核磁共振
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细胞生物学整体实验 全基因敲除小鼠/大鼠
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扫描电镜 基因定点突变细胞系 LncRNA芯片
透射电镜 单基因敲除细胞系 miRNA芯片
HE染色 多基因敲除细胞系 mRNA芯片
免疫组化 目的基因敲入细胞系 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测 报告基因敲入细胞系 SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除细胞系
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荧光原位杂交 基因敲入大鼠/小鼠 SCI论文翻译润色服务
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