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分子生物学检测
荧光定量PCR实验技术对外服务

时间:2020-07-21 13:46:00 浏览:647次

 

一、荧光定量PCR起源

荧光定量PCR(也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR)是美国PEPerkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与变通PCR相比,FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比,FQ-PCR具有许多优点:1、封闭反应,无需PCR后处理。2、特异性强,灵敏度高。3、采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确。4、定量范围宽,可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测,结果直观,避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全,缩短时间,提高效率。荧光定量 PCR是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

荧光定量PCR分类:
TaqMan荧光探针
PCR
扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5-3‘外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
SYBR Green荧光染料
SYBR Green
是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中。从经济角度考虑,它也比其它的探针的价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合,所以一旦反应体系中出现非特异扩增,那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素,可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。


●主要实验步骤如下

RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.
反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.
扩增:PCR的方法扩增cDNA;
3.
检测:实时检测和定量扩增的产物.


二、具体实验操作步骤:

1.设计并合成Realtime PCR引物。
2.
引物溶解后使用PromegaTaqDNA聚合酶进行含SGSYBR® Green)的PCR反应的优化。
3.
客户样品RNA抽提
实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1mlRNA抽提试剂TrizolInvitrogen),匀浆后抽提RNA
实验对象为细胞样品,每份样品取1×1061×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS1mlRNA抽提试剂TrizolInvitrogen),裂解后抽提RNA
4.RNA
质量检测
a.
紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度 。
b.
使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5.
使用逆转录酶(Promega)进行反应,将样品RNA逆转录为cDNA
6.
制备标准曲线样品:
进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7.
标准曲线样品和待测样品分别加入到含SGRealTime PCR反应液中,进行RealTime PCR扩增和检测。
8.
检测结果进行标准曲线分析:以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9.
提供实验报告:包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表 。


三、荧光定量PCR中的一些术语

1.CT值:荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数,或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

2.阈值:阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

3.CT值与起始模板的量成线性关系。

四、主要仪器设备:

Sigma 3-18K高速冷冻离心机 德国Sigma公司

ABI ABI 7500荧光定量PCR仪 美国ABI公司

ZKU-B120超低温冰箱 中国生命科技股份有限公司

Millipore 超纯水系统 美国MILLIPORE公司

微量移液枪 Eppendorf公司

Bio-Rad核酸蛋白测定仪 美国Bio-Rad公司


五、客户须知:



1、请您提供新鲜的且尽量多的材料,或直接提供纯化好的总RNADNA(大于5ug/样本)。如是如织:100200mg

2、请通过EMAIL提供已知的全长基因序列。Email:huameixinan@163.com

3、请提供详细背景资料:DNA/RNA来源,丰度。


六、结果提供:

1、实验详细步骤,和相关数据。

2、标准曲线,扩增曲线,溶解曲线。

3、完整的实验报告(含软件分析结果)


七、最近优惠:

1、引物合成,费用全免。

2、免费提供3次重复的实验结果。

3、引物和探针设计免费。

4RNA抽提费用全免。

5、免费提供RNA保护试剂,上门服务取样。


八、实验完成时间:

30个工作日


九、威斯腾服务流程:





十、威斯腾生物服务项目:

分子生物学检测 蛋白质与免疫学 动物实验
实时荧光定量PCR 单克隆抗体制备 帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP) 多克隆抗体制备 抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 Western-blot 实验服务 脊髓损伤模型
生化指标检测 蛋白双向电泳实验服务 脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测 原核蛋白表达纯化 骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP) 真核蛋白表达纯化 心肌缺血模型
GST pull Down ITRAQ定量蛋白质组学 心力衰竭模型
SLAC蛋白组学 肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化 实验课题整体外包 粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化 整体课题外包 大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化 细胞整体实验外包 慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化 动物整体实验外包 过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化 肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片 原代细胞培养 肝纤维化模型
细胞因子芯片 骨髓间充质干细胞培养 胆结石模型
生长因子芯片 脂肪干细胞培养 急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片 心肌成纤维细胞培养 急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片 软骨细胞培养 体内血栓模型
生长因子芯片 血管内皮细胞培养 关节炎模型
炎症因子芯片 神经元细胞培养 I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片 内皮组细胞原代培养 裸鼠成瘤
凋亡因子芯片 基因编辑动物
趋化因子芯片 电生理相关服务 动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 膜片钳实验
细胞生物学 高通量测序 代谢组学
细胞原代培养 mRNA测序 气相色谱GC/MS
MTT检测 LncRNA测序 液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测 全基因组测序 核磁共震NMR
细胞周期检测 RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验 外显子测序 影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭 16s扩增子测序 Micro-CT
流式分选 Small RNA测序 小动物活体成像
CCK8/XTT检测 宏基因组测序 核磁共振
台盼蓝检测细胞活性 单细胞测序 PET-CT
药物筛选细胞学实验 circleRNA测序
细胞粘附性检测 甲基化测序 基因编辑动物
细胞划痕实验 条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验 全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理学检测 CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 基因芯片
扫描电镜 基因定点突变细胞系 LncRNA芯片
透射电镜 单基因敲除细胞系 miRNA芯片
HE染色 多基因敲除细胞系 mRNA芯片
免疫组化 目的基因敲入细胞系 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测 报告基因敲入细胞系 SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦 miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色 CRISPR/Cas9动物敲除/敲入 科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交 基因敲除大鼠/小鼠 科研文献论著翻译
荧光原位杂交 基因敲入大鼠/小鼠 SCI论文翻译润色服务
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等) 临床实验/科研实验设计方案指导
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【本平台合作项目】
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